试验名称：

HarpinEcc过敏蛋白制剂“信号施康乐”防治烟草花叶病毒室内药效试验

试验委托单位：

四川海博氏生物科技有限公司

承担单位：

中国科学院成都生物研究所

试验地点：

中国科学院成都生物研究所非载体实验室

参加人员：

林燕燕  邵文艳  陈光耀  张珏

超敏蛋白：植物免疫诱抗剂防治烟草花叶病毒室内药效试验报告

含3.3% HarpinEcc过敏蛋白制剂“信号施康乐”系四川海博氏生物科技有限公司研制的新型、安全、高效生物诱抗剂产品，为明确其对烟草花叶病毒病的防治效果，我们在标准条件下对其进行防治烟草花叶病毒病的室内毒力测定和相关实验，报告分三个部分：

一、诱导烟草过敏反应（HR）；

二、诱导拟南芥基因表达谱变化；

三、诱导烟草抗烟草花叶病毒效果。

相关试验设计和结果如下：

试验地点：

中国科学院成都生物研究所非载体实验室温棚

试验设计：

Harpin是由革兰氏阴性植物病原细菌“过敏反应与致病性(hypersensitive response and pathogenity，hrp)”基因簇中的某些基因编码的、性质和功能相似的一类蛋白质，富含甘氨酸、不含胱氨酸、对蛋白质酶敏感、热稳定，大多在寄主植物上具有毒性功能，能在非寄主植物上引起过敏反应(HR)。过敏性反应(hypersensitive reaction , HR) 是植物基本的抗病反应。这种过敏反应表现为非寄主植物受侵染组织快速、局部的萎缩和坏死，从而限制了病原菌的扩散，进而诱导系统抗性，这是植物抵抗病原侵染的普遍表现形式和有效途径。

1 过敏反应测定

采用注射法测定HarpinEcc蛋白制剂诱导烟草的过敏反应。用毫针穿刺烟草叶片，用注射器注射300mg•mL-1的HarpinEcc蛋白制剂 100mL，重复3次，将烟草植株置200C -250C温室培养，观察点样处叶片反应。设无菌水为空白对照。

2 HarpinEcc蛋白制剂诱导烟草的过敏反应结果

分别用HarpinEcc蛋白制剂，无菌水注射于烟草叶片。300mg•mL-1  的HarpinEcc蛋白制剂处理12hr左右引起烟草叶片萎缩、塌陷，24hr该处枯死，产生焦斑，而无菌水对照处理烟草叶片未出现过敏反应。HarpinEcc蛋白制剂以及无菌水处理后24hr的烟草叶片反应结果见图1：

图1（上图和下图）： HarpinEcc蛋白制剂诱导烟草过敏反应。

上图: 烟草照片是右图照片中烟草的左侧处理叶片一部分, 所见焦斑处是经过HarpinEcc蛋白制剂处理24hr左右所形成，其中A、C 点为注射 300 mg•mL-1的HarpinEcc蛋白制剂 100 mL； B、 D 点为注射无菌水100 mL为对照处理。下图: 是经过处理的整株烟草，其中所见焦斑处是经过HarpinEcc蛋白制剂处理12hr左右所形成；该图表明Harpin Ecc蛋白制剂能诱导烟草的过敏反应。

1  材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 30mg•mL-1的HarpinEcc蛋白制剂

1.1.2 基因芯片分析实验用拟南芥为Columbia(Col-0)生态型, 植株莲座叶片生长到14片, 生长阶段为1.14, SD为2.6, CV为10.2, 生长时间25天左右。此供试实验材料描述根据Douglas C Boyes等公布标准。

1.1.3  ATH1基因芯片购于Affymetrix公司, 芯片介绍及质量控制标准参见Affymetrix公司ATH1使用说明。

1.2 基因芯片分析实验设计

为检测HarpinEcc蛋白制剂处理后引起的拟南芥基因表达动态变化, 实验设为6组, 每组使用一株拟南芥, 第1~5组为实验组, 分别在喷施HarpinEcc蛋白制剂后第3 h、12 h、24 h、36h和48 h取样, 第6组为对照组, 不喷施HarpinEcc蛋白制剂。将配制好的30 mg•mL-1的HarpinEcc 溶液3 mL均匀喷施于实验组拟南芥, 喷施时, 均严格与其它参与实验的植株隔离。每组取拟南芥地上部分, 液氮保存, 送上海生物芯片公司, 完成总RNA提取、芯片杂交以及数据提取等工作。

2  HarpinEcc蛋白制剂诱导的拟南芥基因表达时程动力学分析 

通过分析基因芯片在5个实验组样本中检测到的有效基因数(Present gene)和发生显著表达差异基因数(基因表达量与对照基因表达量相比之log ratio≤1或≥1), 结果显示在HarpinEcc蛋白制剂作用后的第3 h、12 h、24 h、36 h以及48 h, 检测到的有效基因数相近, 发生显著表达差异基因数分别为912,1787,2393,1833,1755, 发生显著表达差异基因/有效基因百分数分别为6.9%,14.0%,17.5%,14.0%,13.2%, 参见表1。

拟南芥发生显著表达差异基因数随着HarpinEcc蛋白制剂作用后的时间逐步上升, 到24 h达到最高值, 随后逐渐缓慢下降, 但相比对照和初始检测点(3 h)仍然维持较高水平。证明HarpinEcc蛋白制剂作用于植物体后, 诱导的植物整体反应是一个渐进过程,在24 h左右达到峰值，并且HarpinEcc蛋白制剂的作用具有时间上的持续性, 推测这与Harpin诱导植物产生系统获得性抗性等长效反应相关。

在所有发生显著表达差异的基因中, 有208个基因在5个样本均显著表达上调, 其中96个基因为未知功能基因, 23个基因功能与植物激素相关, 18个基因与植物抗逆性相关, 20个为转录因子蛋白基因, 37个基因功能与光合作用、能量传递相关, 其他功能基因为15个。在与植物激素相关基因中, 生长素相关基因12个, 芸苔素1个, 赤霉素7个, 乙烯2个, 细胞分裂素1个。由此推测HarpinEcc蛋白制剂可能通过诱导生长素、芸苔素、乙烯、细胞分裂素、赤霉素等信号通路促进植物生长发育, 提高抗逆性。

在208个持续表达上调的基因中, 有几个基因值得注意: 植物病程相关蛋白PR-1(At2g14610)和PR-5(At1g18250), PR-1和PR-5是水杨酸依赖途径诱导植物产生系统获得性抗性的标志基因, 植物产生抗病性的生化指标, 这两个基因的持续表达上调证明HarpinEcc蛋白制剂诱导拟南芥产生系统获得性抗性。另外检测到3个thaumatin-like蛋白基因(At1g73620、At2g28790、At4g38660)表达显著上调, 其功能与植物体抵抗真菌和其他病原菌相关。基因At2g27080功能未知, 根据其cDNA序列推测属于Harpin诱导蛋白家族(Harpin-induced family protein)[18], HarpinEcc蛋白制剂作用后诱导At2g27080持续表达上调初步证实At2g27080的表达与Harpin类蛋白作用相关, 但At2g27080是否确实属于Harpin诱导蛋白家族基因以及其表达产物功能等, 还有待进一步研究证明。

将已知和预测的拟南芥1827个转录因子分为56个家族。根据每个家族中发生显著变化的基因数, 筛选与HarpinEcc蛋白制剂作用关系密切转录因子家族。分析表明, 在5个实验组样本中, 筛选到的转录因子家族及其种类既有相同之处又具有差异。整个实验涉及39个转录因子家族中的基因表达发生显著变化, 3 h组涉及基因表达发生显著变化的转录因子家族21个, 12 h组32个, 24 h组26个, 36 h组25个, 48 h组21个。

表1  样本有效基因数及显著表达差异基因数

Table 1  Present genes and regulated genes in the samples

分析表明, 有13个转录因子家族在5个实验组样本中都筛选到, 它们分别是：ZIM、BES1、TCP、C2C2、AP2/EREBP、WRKY、bHLH、bZIP、GARP、MYB、NAC、HB和C2H2家族, 这些转录因子家族主要和以下几个方面的生物学效应相关: 植物抗性相关, 如AP2/EREBP、C2H2、NAC、MYB、bZIP、WRKY家族; 植物开花相关, 如ZIM、TCP、C2H2、bZIP、C2C2、TCP家族; 植物光合作用、生长相关, 如BES1、TCP、C2C2、C2H2、HB、GARP、bHLH家族。每个样本中与HarpinEcc蛋白制剂作用相关转录因子家族见附表一。

其它筛选到的转录因子家族所调控的基因的功能也主要涉及植物抗性和生长发育, 但是在发生时间和持续性上具有差异。HarpinEcc蛋白制剂处理拟南芥后, 处理不同的时间所诱导发生的生物学效应是有差异的, 同时可能诱导植物体发生某些共同的生物学效应, 这些生物学效应主要涉及诱导植物产生系统获得性抗性和促进植物生长发育, 与植物体上宏观可见的HarpinEcc诱导植物抗病原菌、抗逆境和促进生长发育等生物学效应是一致的。

1  药剂

1.1试验药剂及处理剂量

试验用含3.3% HarpinEcc过敏蛋白制剂“信号施康乐”，分别配制成含HarpinEcc蛋白10mg•mL-1、20mg•mL-1、30mg•mL-1和40mg•mL-1几种浓度。

1.2对照试剂及病毒处理剂量

对照试剂：清水对照

TMV病毒处理剂量：125mg/L

2 试验材料与方法

2.1 材料

2.1.1 供试毒源  烟草花叶病毒（TMV）粗提液（浓度为125mg/L），由中国农科院微生物菌种室提供，由本实验室保存。

2.1.2 供试植物  普通烟草

2.1.3 供试药剂  HarpinEcc 蛋白制剂

2.2 方法

2.2.1 HarpinEcc蛋白制剂的诱导抗性处理

配制HarpinEcc蛋白制剂的系列浓度为10、20、30、40mg•mL-1，以清水为空白对照。选取生长一致的四、五叶期烟草幼苗，做以下处理：将配制的各浓度HarpinEcc溶液，均匀喷至叶片上至不流失为度，强化诱导三次。在第7天分别人工摩擦接种125mg/L浓度 的TMV 溶液于烟草第三、四的叶片上，置于250C条件下培养，各个处理均以3 株为一个重复组，重复3 次。

2.2.2 病情调查

2.2.2.1 病情调查方法及分级标准

根据中华人民共和国烟草行业标准——烟草病害分级及调查方法，调查记载总叶数，病叶数，病情严重度，计算病叶率，病情指数和防效。

病害严重度分级标准0级：全株无病；

1级：心叶脉明或轻微花叶，或上部三分之一叶片花叶但不变形，植株无明显矮化；

2级：三分之一至二分之一叶片花叶，或少数叶片变形，或主脉变黑，植株矮化为正常株高的三分之二以上；

3级：二分之一至三分之二叶片花叶、或变形或主侧脉坏死，或植株矮化为正常株高的三分之二至二分之一；

4级：全株叶片花叶，严重变形或坏死，病株矮化为正常植株高度的二分之一以上至三分之一。

调查方法 ：以株为单位分级调查。

2.2.2.2 结果计算公式

3  结果与分析

HarpinEcc蛋白制剂诱导烟草抗TMV效果见附表。不同浓度HarpinEcc蛋白制剂处理均能诱导烟草对TMV的抗性。由调查结果（附表二）可知，各处理浓度均能达到一定的相对防治效果，且效果很明显。F检测结果发现，所有处理与空白对照相比，各处理浓度的病情指数均在0.01和0.05水平上明显低于对照，差异极显著，其中当HarpinEcc的浓度为30 mg•mL-1时，相对防效最高，可达65.84%。由附表三可知，用30mg•mL-1 HarpinEcc处理10 d后，诱导抗性表现出来，相对防效可达到66.27%，由调查结果可知，经30 mg•mL-1 HarpinEcc处理后不同天数内相对防效一直可以保持在60%以上水平，由此可知，HarpinEcc对TMV的诱导抗性持效期可超过30 d。

4 药效评价

从本试验结果可以看出，含3.3% HarpinEcc过敏蛋白制剂“信号施康乐”对生长期人工接种的烟草花叶病毒（TMV）有很好的的防治效果，该蛋白对植物病原不具有直接的抑制或毒杀效果,而是通过诱导植物产生系统获得性抗性和促进生长发育来提高植物防御病原菌的危害，无毒性，不破坏生物多样性，无残留，无公害，环境相容性好，长期或多次诱导不会使植物病原菌产生抗药性、是农业安全生产技术体系中一种新型环保生物蛋白，因而必将成为一代新型、安全、稳定、高效的植物生长调节剂和生物农药，值得大力开发和推广的。

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